Plateau Imagerie Cellulaire

Le plateau technique d’imagerie cellulaire du Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan offre un large choix de techniques disponibles dans le domaine de la biophotonique pour visualiser des évènements biologiques de l’échelle nanométrique jusqu’à l’échelle de l’organe.

L’accès aux équipements est ouvert aux équipes de recherches publiques internes ou extérieures au CPTP ainsi qu’aux entreprises privées.

Dans le cadre de son rattachement à la Plateforme technologique des sciences du vivant Toulouse Réseau Imagerie (TRI), le plateau d’imagerie du CPTP est certifié ISO9001 version 2015 et NF X 50-900 version 2016 afin d’assurer une amélioration continue et la satisfaction de ses utilisateurs.

L'équipe

Responsable : Sophie Allart


Prestations de service

Pour tout nouvel utilisateur, un entretien préalable permet de mettre en place le protocole de préparation des échantillons et de planifier la réalisation de votre expérience. Dans le cadre de ses activités, le plateau offre deux types de prestations :

  • La mise en autonomie : après une formation sur l’équipement adapté, l’utilisateur est autonome et peut réserver lui-même des créneaux pour l’utilisation du microscope.
  • Réalisation- expertise : Le personnel du plateau vous accompagne dans la mise au point et le développement de projets de recherche sous forme de collaborations adossées à vos projets scientifiques.

Formation, conseil, expertise

  • Formation à l’utilisation des appareils
  • Aide à la mise en place ou l’optimisation d’un protocole expérimental
  • Assistance à l’utilisation de certaines techniques
  • Aide à l’analyse d’images
  • Expertises pour les laboratoires privés
  • Formation continue (INSERM, CNRS, Université, Entreprises privées, Workshop)

Applications

Techniques disponibles sur le plateau

  • Imagerie spectrale
  • Imagerie cellulaire dynamique
  • FRET
  • TIRF
  • FRAP/ FLIP/ iFRAP
  • IRM (Interference Reflection Microscopy)
  • Biphoton
  • dSTORM
  • STED
  • Photoactivation
  • uPAINT

Analyses d’images

  • Quantification d’objets
  • Quantification d’intensité de fluorescence
  • Colocalisation
  • Automatisation des taches par macro commandes
  • Analyse 4D grâce à Imaris
  • ImageJ
  • Formation à l’analyse d’images

Équipements

Le plateau technique du CPTP vous propose des outils pour imager vos échantillons de l’échelle cellulaire à l’échelle tissulaire.

Microscope bi-photon ZEISS LSM 7 MP droit

  • Les cellules de Purkinje sont marquées avec de la calbidin (rouge), les noyaux avec du Dapi (cyan) et le complexe majeur d’histocompatibilité de type I en vert – Lidia Yshii, Equipe Roland Liblau

    Microscope multiphoton ZEISS LSM 7 MP droit, permettant l’observation cellulaire et tissulaire en multicouleur, grâce à ses 5 NDD en réflexion sur statif droit motorisé. Le LASER pulsé femtoseconde Chaméléon ultra II est accordable de 690 à 1080 nm.

  • Les objectifs présents sont un 20X plongeant plan apo (ON: 1), un 40X plan apo à immersion à huile (ON: 1.4) et un 40X à immersion à eau (ON: 1,1).
  • Le microscope est complètement encagé et régulé en CO2 pour le maintient des cellules en conditions environnementales optimales.
  • Il est équipé pour l’explantation tissulaire durant plusieurs heures (oxygénation et thermorégulation), et pour la microscopie chez le petit animal.

Réservation

Tutoriel 7MP

Tutoriel Live

 

Microscope Champ Large

Vidéo-microscope 4-5D à déconvolution pour l’observation tri-dimensionnelle de cellules vivantes multi-marquées, à haute résolution spatiale et temporelle.

Statif inversé ZEISS Axiovert 200 implémenté d’un piezo (100 um) et d’une caméra CCD refroidie Coolsnap HQ, d’un monochromateur Optoscan CAIRN, le tout piloté par les logiciels Metamorph ou Metafluor (mesure du flux calcique).

Le microscope est complètement encagé pour permettre des acquisitions prolongées.Il est particulièrement adapté pour la quantification du flux calcique intracellulaire à l’aide d’une sonde ratiométrique comme le Fura-2.

De plus, la stabilité de la thermorégulation en fait un outil de choix pour le suivi prolongé dans le temps de cellules en mouvement.

Les objectifs sont 10X, 40X, 63X, 100X.
Acquisition en 1997, mise à niveau en 2004-2005.

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Microscope Apotome 2

Meryem Aloulou, Equipe Nicolas Fazilleau

  • Ce microscope peut être utilisé comme un champ large mais il permet aussi de faire des sections optiques et ainsi d’éliminer la fluorescence hors focus.
  • Grâce à ce système il est possible de faire de grandes mosaïques avec un positionnement et un affichage parfait des différentes tuiles.
  • Il est aussi possible de retrouver les positions exactes de différents points (exemple: plaque 96 puits) sur plusieurs jours ce qui permet de faire un suivi au cours du temps de l’évolution d’une expérience.
  • Enfin, ce microscope peut être utilisé pour l’étude d’évènements dynamiques ne nécessitant pas de régulation de l’environnement, jusqu’à une vitesse d’acquisition d’une image par seconde (exemple: étude de flux calcique).
  • Le statif inversé comprend des objectifs 10 X, 20X, 40X et 63X et des cubes pour imager le Dapi, vert (GFP, FITC, Alexa 488….), rouge (Cy3, DsRed…) et rouge lointain (Cy5, …) et utilise une HXP 120 comme source d’illumination. Il est aussi équipé d’une caméra haute résolution.

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Réservation

Microscope confocal Spinning Disk- TIRF- FRAP

  • Equipé de deux lasers dans l’UV à 375 nm et 405 nm et de 3 lasers dans le visible : 491, 561 et 642 nm sur statif inversé.
  • Les objectifs présents sont un 10X plan apo (ON 0.75) pour l’observation de plaques, un 20X plan apo (ON 0.75),un 40X à immersion à huile fluor (ON 1.3) pour les expériences nécessitant le laser 375nm,  un 60X plan apo à immersion à huile (ON 1.4) et un objectif 100X apochromate à immersion à huile (ON 1.49) pour les experiences de TIRF. Tous ces objectifs sont équipés pour le DIC.
    La tête confocale CSU-X1 permet l’acquisition ultra rapide des images en limitant le photobleaching.
  • Le module iLas² permet de faire des expériences de FRAP/FLIP/Photoactivation ainsi que du TIRF azimutal et du PALM.
  • Le microscope est complètement encagé et régulé en CO2 pour le maintien des cellules en conditions environnementales optimales.

 

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Réservation

Microscope confocal Zeiss LSM 710

A mouse hippocampal neuronal culture infected by Toxoplasma gondii tachyzoïtes (Red: MAP2, Blue: GFAP, Green: T. gondii), Marcy Belloy, Equipe Blanchard

  • Equipé d’une diode UV (405nm) et de 3 lasers dans le visible (un laser argon multi-raies à 458 nm, 477 nm, 488 nm, et 514 nm,et deux lasers hélium-néon à 543 nm et 633 nm), sur statif inversé motorisé.
  • Les objectifs présents sont un 20x plan apo (ouverture numérique: 0.8) et un 63x plan apo (ouverture numérique 1.4) à immersion à huile.
  • La possibilité de thermorégulation de la préparation permet l’acquisition d’échantillons vivants au cours du temps.
  • L’analyse spectrale permet de soustraire l’autofluorescence, ou de séparer des fluorochromes dont les spectres d’excitation et d’émission se recouvrent.
  • Des modules de FRAP et de colocalisation sont également disponibles.

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Réservation

 

Microscope confocal Zeiss LSM 510

  • Coopération entre mastocytes (granules par une sonde fluorescente rouge) et des lymphocytes T CD4 (actine marquée à l’aide de la phaloidine 488). On note une polarisation de l’actine du lymphocytes T vers la mastocyte au niveau de la synapse
    Malik Hamaida, Equipe Salvatore Valitutti

    Équipé de 3 lasers dans le visible (un laser argon multi-raies à 458 nm, 477 nm, 488 nm, et 514 nm,et deux lasers hélium-néon à 543 nm et 633 nm), sur statif inversé motorisé.

  • L’ analyseur spectral META offre la possibilité de séparer 8 fluorochromes différents dont les spectres d’excitation ou d’émission se recouvrent.
  • Les Objectifs présents sont un 10X plan néofluar (ON: 0,3) et un 20 X plan apo (ON: 0,8) pour l’observation globale, un 40X plan apo (ON: 1,3), un 63X plan apo (ON: 1,4) et un 100X plan apo (ON: 1,4) à haute résolution pour l’observation sub-cellulaire.
  • La possibilité de thermorégulation de la préparation permet l’acquisition d’échantillons vivants au cours du temps.
  • Des modules de FRAP et de colocalisation sont également disponibles.
  • Le traitement d’image est réalisé soit avec  le logiciel ImageJ, ou bien avec le logiciel Metamorph.

Réservation

Microscope confocal Leica SP8- STED 3X

  • Mise en évidence du virus Zika dans les spermatozoïdes humains par microscopie de super-résolution STED. Tom20-StarRed (Mitochondries en vert) et 4G2-Alexa-594 (Virus Zika en violet). Elsa Suberbielle, équipe Dunia, CPTP.

    Equipé d’une diode UV (405nm) et de 4 diodes dans le visible (488 nm, 532 nm, 552nm et 635 nm), sur statif inversé motorisé.

  • Pour le STED, les lasers d’excitation disponibles sont les 532 et 635 nm. Le laser de dépletion est le 775nm.
  • Les objectifs présents sont un 20 X Plan Fluotar DIC (ouverture numérique: 0.8), un 63x plan apo DIC (ouverture numérique 1.4) à immersion à huile ainsi qu’un 100X d’ouverture numérique 1.4 utilisable uniquement pour les expériences de STED.
  • Le système est équipé de 3 hybrides détecteurs de très haute sensibilité (avec un rendement quantique de 45% contre 25% pour des PMTs classiques) ainsi que deux photomultiplicateurs.
  • La possibilité de thermorégulation de la préparation permet l’acquisition d’échantillons vivants au cours du temps.
  • Attention: la thermorégulation se fait grâce à la Brick d’Ibidi qui nécessite l’utilisation de supports Ibidi.

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Réservation

Traitement & analyse des images

Analyse de l’expression de la GFP dans une région de l’hippocampe (Gyrus Denté) de la souris, après injection stéréotaxique d’un vecteur lentiviral. Les noyaux sont marqués avec du DAPI (bleu)A. Betourne, Equipe Dunia

Le plateau d’imagerie met à disposition pour l’analyse 2 postes de travail en libre service (réservation conseillée) pour le traitement et l’analyse d’images. Ils sont également utilisés pour déconvoluer les images issues du champ large en utilisant des techniques de calcul distribué. A la demande, les ingénieurs du plateau écrivent des séquences d’automatisation sous ImageJ (macros) afin d’automatiser l’analyse d’images. Des formations sont régulièrement organisées afin de favoriser la prise en main des principaux logiciels d’imagerie.

Les logiciels mis à disposition sont :

      • Metamorph (Universal Imaging): Logiciel d’acquisiton et d’analyse d’images présent sur la plupart des systèmes d’acquisition de la plateforme (hors microscopes confocaux). Il permet le traitement et l’analyse d’images 2D et la création d’automatisation de tâches pour les processus répétitifs.
      • ImageJ: logiciel  gratuit téléchargeable ici d’analyse d’images 2D et 3D. Il permet la création d’automatisation de tâches pour les processus répétitifs.
      • Imaris: Logiciel de traitement et d’analyse de piles d’images 3D. Il permet la modélisation de surfaces, la détection de spots et leur suivi au cours du temps (tracking), la reconstruction de prolongements cellulaires (dendrites et épines par exemple), l’ensemble associé à des données statistiques. Il permet également de créer des animations pour les présentation et supportent les principaux formats de fichiers issus de la microscopie.
      • Zen Light et LSM Browser (Zeiss): pour la visualisation des images acquises avec les microscopes Zeiss (fichiers .lsm et .czi).
      • LAS AF Leica Lite: pour la visualisation des images acquises avec le microscope Leica SP8 (fichiers .lif).

RNA FISH visualization of TLR7 escape from X inactivation in a memory B lymphocyte, Mélanie Souyris, Eq JC Guéry

 

 

 

Manuel d’utilisation de FigureJ

Manuel d’utilisation d’ImageJ

Contact & réservation


Le plateau technique est accessible en libre service après une formation obligatoire, et sur réservation (planning électronique). Une validation doit être demandée sur le site de Toulouse Réseau Imagerie pour chaque utilisateur.

Le plateau d’imagerie cellulaire du CPTP est localisé à Toulouse sur le site de l’hôpital Purpan, au deuxième étage du batiment F, Pavillon Lefebvre, CHU Purpan.

Actualités


Formations
Le plateau organise régulièrement des formations à destination des partenaires publics et privés.

En 2018, plusieurs formations auront lieu:

– Une formation à l’analyse d’images avec ImageJ (1ere partie : 5 et 6 avril, deuxième partie : 17 et 18 mai avec une journée optionnelle pour l’initiation aux macros).

Une seconde formation pour ImageJ est prévue pour l’automne 2018. Dates à déterminer.
Inscription sur Sirène ou pour les non INSERM par mail à joelle.couhet@inserm.fr
Intervenantes: S. Allart et A. Canivet-Laffitte

– Une formation à l’analyse d’images avec Imaris les 4, 5 et 6 juin.
Inscription sur Sirène ou pour les non INSERM par mail à joelle.couhet@inserm.fr
Intervenants: Sophie Allart et Sébastien Marais (BIC, Bordeaux).

– Formation Microscopie intravitale et endoscopie du 12 au 14 novembre 2018.

Plus d’infos

– Formation Microscopie de fluorescence: Bases et nouveautés du 15 au 19 octobre 2018.

Plus d’infos

 

Autre

La garantie d’un réseau de compétences et d’une qualité de services

Membre  de TRI-GENOTOUL (Toulouse Réseau Imagerie) ISO 9001:2008 depuis janvier 2010 et NF X50-900 depuis février 2014.

Membre du RTMFM – Microscopie Photonique de Fluorescence Multidimensionnelle.

Membre du GDR 2588 CNRS-Microscopie fonctionnelle du vivant.

 

Autres informations


Le comité de pilotage
  • Dr S. Guerder (CPTP- Eq Guerder)
  • Dr N. Blanchard (CPTP-Eq Blanchard)
  • Dr P. Romagnoli (CPTP-Eq Van Meerwijk)
  • Dr M. Savignac (CPTP -Eq. Guery)
  • Dr F. Briand –Messange (CPTP-Eq. Salles)
  • Dr M. Requena (CPTP-Eq Izopet)
  • Dr R. Lesourne (CPTP-Eq Lesourne)
  • Dr D. Gonzalez-Dunia (CPTP-Eq Dunia/Casper)
  • Dr Saoudi (CPTP-Eq Liblau/Saoudi)
  • Dr C. Leprince (UDEAR)
  • Dr N. Vergnolle (IRSD)
  • Dr N. Gaudenzio (UDEAR)
  • Dr L. Dupré (CPTP)
Publications

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